Annexin V凋亡試劑盒常見問題及解決方案

Q：Annexin V凋亡檢測試劑盒的原理是什么？

A：Annexin V是一種鈣離子依賴性磷脂結合蛋白，與磷脂酰絲氨酸PS有高度親和力，可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞胞膜結合，將Annexin V標記熒光染料如FITC利用流式細胞儀或熒光顯微鏡可檢測細胞凋亡。

碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)或7-AAD可與雙鏈DNA特異性結合，并產生強烈的熒光，正常情況下無法透過細胞膜。由于凋亡晚期或壞死細胞膜喪失完整性，核染料PI或7-AAD可進入細胞內對DNA進行染色，與Annexin V搭配使用，可區分處于不同凋亡時期的細胞。

Q：Annexin V凋亡檢測結果如何看？

A：

1.Annexin V^-PI^-—活細胞，Annexin V和PI都無法染上；

2.Annexin V⁺PI^-—早期凋亡細胞，細胞PS外翻與Annexin V結合，細胞膜完整，PI無法染上；

3.Annexin V⁺PI⁺—晚期凋亡或壞死細胞，細胞PS外翻與Annexin V結合，細胞膜受損，PI染料可以進入細胞內與DNA結合；

4.Annexin V^-PI⁺—裸核細胞，細胞膜結構喪失無法與Annexin V結合，PI可以進入細胞與DNA結合；

Q：如何統計凋亡細胞數？

 A：Annexin V凋亡實驗在做凋亡統計時一般統計總的凋亡比例（早期凋亡和晚期凋亡或壞死細胞之和），也有文獻統計細胞早期凋亡率。

Q：血液樣本是否可以用于凋亡檢測？

A：不建議檢測血液樣本，血液中血小板及很多免疫細胞自身存在PS外翻的情況，會影響檢測結果。

Q：檢測凋亡用的細胞能否固定？

A：甲醛固定液會造成結果假陽性，因此用于Annexin V凋亡檢測的細胞不能進行固定。

需要注意的是，Annexin V檢測的樣本為外周血時，勿使用含有多聚甲醛等固定液成分的紅細胞裂解液來處理細胞。

Q：Annexin V系列有很多種不同組合試劑盒，該如何選擇？

A：挑選合適的Annexin V試劑盒，主要考慮兩個方面：一是流式細胞儀的配置，二是細胞是否自帶熒光（如轉染了熒光的細胞、帶熒光的藥物來孵育細胞），在流式細胞儀配置允許的前提下，選擇與細胞自發熒光使用不同檢測通道的Annexin V試劑盒。

Q：說明書上寫細胞量為1~5×10⁵，細胞量多的話對檢測結果有沒有影響？

A：建議細胞量最多不要超過10⁶個，過量的細胞相當于染料被稀釋，影響染色和分離效果。一般2×10⁵個細胞足夠進行凋亡檢測了，通常情況下檢測10,000個細胞就能得到比較好的結果。

Q：是否可以用PBS替代凋亡試劑盒里面的Binding Buffer？

A：不可以，Annexin V與PS的結合依賴Ca²⁺，Binding Buffer含有Ca²⁺，主要是促進Annexin V與PS的結合。不加Binding Buffer，會導致Annexin V的結合能力降低，造成陽性信號大幅下降甚至無陽性信號。

Q：如何設置補償管？

A：實驗設計時，考慮到補償，建議設置全單染管調節補償，如果樣本有明顯的自發熒光，且自發熒光對選擇的染料有干擾，則必需設置一管只有自發熒光的細胞管(對于表達熒光蛋白的細胞，不加任何試劑的空白對照組作為EGFP的單陽組；對于有熒光的藥物，細胞只加藥物處理，作為藥物的單陽組)，用來調節補償，以扣除自發熒光對其它通道的干擾。

Q：染色完不能及時上機，樣本能否固定？

A：細胞染色完成后，禁止固定，盡快檢測，如無法立即檢測，可將樣本管放冰上，以減少外界環境對檢測結果的影響，Annexin V結合不穩定，請務必在標記結束后半小時內檢測。如果實驗室距離上機的地方較遠，建議將細胞和試劑盒帶到上機的地方，染色后立即檢測。

Q：凋亡檢測中如何設置對照組？凋亡檢測時細胞全部檢測都是陽性是什么原因？

A：Annexin V凋亡檢測中，陰陽性的界定不是依據空白組（細胞中不加PI也不加Annexin V），而且依據陰性對照組（細胞不經過藥物處理，但是加入PI和Annexin V）。這是因為一般情況下，凋亡檢測中，加入PI和Annexin V之后是不洗滌的，這意味著溶液有本底的熒光，陰性對照的信號比空白組高，如果以空白組來定陰陽性界限會出現大量假陽性細胞。

Q：細胞里有一個過表達載體，表達出綠色熒光蛋白EGFP，需要避開綠色通道，該如何選擇凋亡試劑盒？

A：如果檢測的流式細胞儀有DAPI通道，可以選擇P-CA-248 Annexin V-APC/DAPI熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒，三種熒光之間沒有補償。如果沒有DAPI通道，可以選擇P-CA-208 Annexin V-APC/7-AAD熒光雙染細胞凋亡檢測試劑盒，但要注意合理設置單染管（包括只有自發熒光的細胞管，否則7-AAD通道信號會出現干擾），用來調節補償。